種植修復(fù)的成功不僅取決于良好的骨結(jié)合，還需要種植體或基臺(tái)與周?chē)浗M織形成良好的生物封閉，從而減少種植體周?chē)?xì)菌等病原體的滲入，預(yù)防種植體周?chē)膊〉陌l(fā)生［1］。鈦?zhàn)鳛榉N植體和基臺(tái)的“金標(biāo)準(zhǔn)”材料在臨床中應(yīng)用廣泛，而如何對(duì)其表面進(jìn)行改性以提高其與軟組織的黏附，已成為種植修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，學(xué)者們圍繞鈦表面仿生化改性進(jìn)行了多個(gè)方向的研究，在鈦材料與軟組織黏附性能的提高方面展示出良好的應(yīng)用前景。本文將著重對(duì)鈦材料表面仿生涂層構(gòu)建、表面仿生修飾及與軟組織黏附的評(píng)價(jià)方法等方面做一綜述。

1、常見(jiàn)仿生涂層

仿生涂層通常是指利用天然生物合成的方法或模仿各種生物特性而開(kāi)發(fā)的涂層材料。

1.1絲素蛋白涂層

絲素蛋白是從蠶絲或蜘蛛絲中提取的天然高分子纖維蛋白，含量約占蠶絲的70% ~ 80%，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，如手術(shù)縫線(xiàn)和組織再生等。絲素蛋白具有良好的生物相容性、可控降解性和機(jī)械性能。研究表明，材料中加入絲素蛋白可提高基質(zhì)的力學(xué)性能，并可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的黏附及生長(zhǎng)［2-3］。細(xì)胞在具有絲素蛋白涂層的鈦種植體表面具有良好的黏附和擴(kuò)散能力，且細(xì)胞增殖能力無(wú)顯著變化。同時(shí)，絲素蛋白的疏水性使其在口腔潮濕環(huán)境內(nèi)可以穩(wěn)定存在。此外，絲素蛋白的氨基酸側(cè)鏈可進(jìn)行功能化修飾，Vidal 等［4］利用鈦結(jié)合肽（titanium bindingpeptide，TiBP）和精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸（argi?nine-glycine-aspartic acid，RGD）多肽序列對(duì)絲素蛋白進(jìn)行功能化改性，構(gòu)建了雙功能化的絲素蛋白涂層，TiBP 可增加蛋白質(zhì)在金屬表面的吸附作用，而RGD 多肽序列在調(diào)控細(xì)胞的黏附中具有重要作用。不僅增加了絲素蛋白與鈦的結(jié)合力，同時(shí)也改善了成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在鈦表面的增殖能力和黏附強(qiáng)度。Nileb?ck 等［5］將生物膜分散酶分散蛋白 B（dispersin B，DspB）或內(nèi)溶酶功能化絲素蛋白，該涂層可在促進(jìn)細(xì)胞活力的同時(shí)減少細(xì)菌的黏附，從而為降低種植體周?chē)椎陌l(fā)生風(fēng)險(xiǎn)提供了可能。值得注意的是，蠶的品種可能會(huì)影響絲素蛋白的生物相容性。天蠶分泌的絲素蛋白具有 RGD 多肽序列，因而表現(xiàn)出更高的細(xì)胞親和力，而天然桑蠶絲不存在這一序列［6］。但天蠶難以養(yǎng)殖，使得此類(lèi)絲素蛋白的廣泛臨床應(yīng)用受到了影響，而目前通過(guò)基因工程技術(shù)可實(shí)現(xiàn)大量合成并優(yōu)化天然蛋白，已很好解決以上問(wèn)題。綜上，鈦表面構(gòu)建絲素蛋白涂層是促進(jìn)種植體周?chē)浗M織黏附的方向之一［7］，具有良好的應(yīng)用前景。

1.2聚多巴胺涂層

無(wú)脊椎動(dòng)物如貽貝，即使在潮濕的環(huán)境下也能牢固地附著在不同的基質(zhì)上，而其高強(qiáng)度的附著力來(lái)源于多巴胺［8］。聚多巴胺（polydopamine，PDA）是以貽貝多巴胺為靈感的合成聚合物，自 2007 年作為涂層材料問(wèn)世以來(lái)發(fā)展迅速。PDA涂層也引起了口腔種植領(lǐng)域研究的關(guān)注。鈦材料表面具有疏水性和生物惰性，而 PDA涂層的構(gòu)建可以顯著促進(jìn)其親水性，促進(jìn)蛋白質(zhì)吸附和細(xì)胞黏附。Yang等［9］在經(jīng)堿熱處理過(guò)的鈦表面構(gòu)建 PDA 涂層，結(jié)果表明，負(fù)載 PDA 的鈦種植體表面能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞在種植體表面的黏附、增殖和鋪展，增加了Ⅰ型膠原的分泌和纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）在鈦表面的吸附，顯著改善了鈦種植體周?chē)能浗M織整合功能。另一方面，PDA 涂層對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌還具有抑制作用［10-12］。因此，PDA 涂層的優(yōu)勢(shì)在于：①制備方法簡(jiǎn)單高效，僅需要將基質(zhì)材料浸入堿性多巴胺溶液即可完成制備［9，13］；②生物相容性良好；③PDA 膜富含鄰苯二酚和氨基基團(tuán)，可作為載體來(lái)負(fù)載膠原、羥基磷灰石（hy?droxyapatite，HA）、羧甲基殼聚糖（carboxymethylchitosan，CMCS）等成分，進(jìn)一步增強(qiáng)軟組織細(xì)胞的功能［9，12］；④制備不受基質(zhì)材料限制（金屬、聚合物、瓷材料均可），也不受基質(zhì)的形狀和大小的影響［14］。

1.3殼聚糖涂層

殼聚糖（chitosan，CS）是從天然多糖甲殼素中提取的一種脫乙?；嗵?，在結(jié)構(gòu)上與細(xì)胞外基質(zhì)相似，因此對(duì)人體細(xì)胞具有很強(qiáng)的親和性。另外，CS 具有良好的生物相容性和抗菌活性，可作為鈦種植體表面載藥的載體。雖然CS血液相容性不足（因其在體內(nèi)的降解產(chǎn)物殼寡糖可誘導(dǎo)人紅細(xì)胞黏附和聚集），但與其他聚合物或其他生物材料混合使用可以改善此缺陷。如CS與磷酸三鈣結(jié)合可以促進(jìn)體內(nèi)血管生長(zhǎng)，CS與L-谷氨酸（L-glutamic acid，LG）結(jié)合可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，同時(shí)增加膠原合成和沉積，明顯加快創(chuàng)面愈合速度［15］。Lin 等［16］利用CS在鈦合金表面構(gòu)建涂層促進(jìn)了細(xì)胞的增殖能力；同時(shí)，與藻酸鹽和果膠交聯(lián)可進(jìn)一步增強(qiáng) CS 表面細(xì)胞的初始增殖能力，顯著提高了涂層的剝離強(qiáng)度。但值得注意的是，也有研究表明 CS 具有高度的細(xì)胞選擇性，表現(xiàn)為 CS 表面與成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞具有強(qiáng)的黏附能力，而與成纖維細(xì)胞的黏附能力較弱［17］。因此，關(guān)于鈦表面CS涂層的軟組織反應(yīng)仍需進(jìn)一步明確。

2、仿生涂層的制備方法

目前研究中仿生涂層的制備方法主要包括溶液浸漬法、溶液旋涂法、電沉積法（電泳沉積技術(shù)）、等離子噴涂技術(shù)等。鈦材料表面通常預(yù)先進(jìn)行拋光或堿熱處理活化［9］。

2.1浸漬法

浸漬法又稱(chēng)提升法，是將基質(zhì)材料直接浸漬在具有活性組分的溶液或溶膠中，從而使活性組分以膜的形式固定在基質(zhì)材料上。浸漬法具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便的優(yōu)點(diǎn)，但制備的涂膜不易均勻，成膜厚度也不可控。PDA 的仿生涂層制備目前多采用浸漬法，將鈦基質(zhì)材料浸入鹽酸多巴胺溶液中（質(zhì)量濃度為2 mg/mL），室溫下攪拌或靜置隔夜，去離子水沖洗去除多余物理吸附的PDA后干燥即可［9］。

2.2旋涂法

旋涂法又稱(chēng)旋轉(zhuǎn)涂覆法，即將基質(zhì)材料固定在旋轉(zhuǎn)的圓盤(pán)上，依靠旋轉(zhuǎn)時(shí)的離心力，使得涂料在基質(zhì)材料上均勻成膜，旋涂法成膜較浸漬法均勻，但缺點(diǎn)在于不易大面積成膜。

2.3電沉積法

電沉積法包括直接電沉積法、熔融凝膠沉積法。直接電沉積法是將鈦材料連接到電源正極，并浸入到絲素蛋白溶液中，負(fù)極連接鉑絲，鉑絲距離鈦材料8 ~ 10 mm，凝膠化后，干燥即可。熔融凝膠沉積法是將溶液制備的電凝膠完全熔化，并在隨后浸漬程序過(guò)程中始終保持凝膠的熔化狀態(tài)。但值得注意的是，仿生涂層不宜過(guò)厚，否則可能會(huì)出現(xiàn)涂層分層現(xiàn)象。通過(guò)對(duì)施加電壓、沉積時(shí)間、溶液濃度的調(diào)節(jié)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)涂層厚度的控制［18］。

研究表明，電沉積法制備絲素蛋白涂層較浸漬法和旋涂法具有更多的優(yōu)勢(shì)，電沉積過(guò)程可將帶電的絲素蛋白分子排列組裝到帶電的基質(zhì)材料上，蛋白結(jié)合更加緊密，與鈦表面的黏附力更強(qiáng)［18］。同時(shí)，電沉積法形成涂層速度快，厚度更加合適。絲素蛋白溶液的配制可以參考標(biāo)準(zhǔn)操作流程［19］。

3、表面仿生修飾

上述仿生涂層是以天然生物為靈感，模仿各種生物特性的涂層技術(shù)，而表面仿生修飾又稱(chēng)生物功能化技術(shù)，是將蛋白質(zhì)、肽等有機(jī)成分直接或間接固定在材料表面以改變其生化特性和生物反應(yīng)的技術(shù)。近年來(lái)，學(xué)者們嘗試了表面仿生修飾技術(shù)，在鈦材料表面直接或間接固定膠原、黏附相關(guān)蛋白、RGD 多肽序列、生長(zhǎng)因子等，以改善鈦表面與軟組織的相容性。

3.1膠原

膠原是結(jié)締組織的主要構(gòu)成成分，其可作為新組織形成的骨架，對(duì)細(xì)胞起到支持作用，并為細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)提供良好的微環(huán)境。膠原由于其優(yōu)異的生物相容性、可降解性、凝血性等性能廣泛用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。Zhu 等［14］的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)膠原修飾的鈦種植體表面顯著促進(jìn)了成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的黏附，貼壁細(xì)胞密度更高，細(xì)胞鋪展更好，偽足形成更多。同時(shí)，大鼠皮下植入實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)膠原修飾的鈦種植體周?chē)浗M織中炎細(xì)胞浸潤(rùn)和肉芽組織形成少，組織相容性更佳。但也有研究提出，膠原修飾過(guò)程并不會(huì)導(dǎo)致鈦種植體周?chē)浗M織的垂直尺寸增加［20］，這提示體外細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)出的陽(yáng)性結(jié)果，在體內(nèi)研究中卻未能具有相應(yīng)組織學(xué)反應(yīng)。

3.2黏附相關(guān)蛋白

細(xì)胞外基質(zhì)中的黏附相關(guān)蛋白包括FN、玻連蛋白、層粘連蛋白（laminin，LN）等，作用主要為將細(xì)胞錨定在細(xì)胞外基質(zhì)中。研究表明，F(xiàn)N固定在鈦表面可以刺激黏著斑形成和基質(zhì)合成，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，改變細(xì)胞黏附和增殖相關(guān)基因的表達(dá)［21］。FN 促進(jìn)成纖維細(xì)胞的連接，而LN促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的附著。實(shí)驗(yàn)證明在鈦種植體表面固定 LN 衍生的多肽 LamLG3，可以增強(qiáng)涂層的機(jī)械和熱化學(xué)穩(wěn)定性，并可以增強(qiáng)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和半橋粒的形成［22］。

3.3RGD 多肽序列

RGD 多肽序列存在于細(xì)胞外基質(zhì)中，具有高度保守性，通過(guò)與細(xì)胞表面整合素特異性結(jié)合而調(diào)控細(xì)胞的黏附過(guò)程。研究表明，RGD 多肽序列修飾的鈦表面可以顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞黏附活性，而當(dāng)精氨酸或天冬氨酸殘基被取代時(shí)，細(xì)胞結(jié)合活性喪失或降低［4，6］。相較于蛋白質(zhì)修飾中存在的免疫原性、可降解性以及疏水表面可導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性等缺點(diǎn)，肽修飾表面的穩(wěn)定性和成本效益更高，具有更好的研究?jī)?yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景。

3.4生長(zhǎng)因子

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblastgrowth factor，F(xiàn)GF）可以調(diào)節(jié)各種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的分泌，促進(jìn)新血管的形成。在二氧化鈦納米管表面固定FGF2可顯著改善成纖維細(xì)胞的功能，如細(xì)胞附著增殖和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)。但值得注意的是，其生物活性具有明顯的雙向性、濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性，過(guò)高質(zhì)量濃度的FGF2可能反而對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖活性產(chǎn)生抑制作用，F(xiàn)GF2質(zhì)量濃度推薦為500 ng/mL［23］。

綜上，鈦表面經(jīng)仿生修飾后表現(xiàn)出更優(yōu)異的組織相容性，在促進(jìn)鈦材料與軟組織的黏附、提高種植修復(fù)周?chē)浗M織封閉方面具有很好的應(yīng)用前景。修飾層會(huì)受到口腔唾液環(huán)境、冷熱疲勞、機(jī)械刺激以及各種酶的作用。因此，如何固定這些功能成分，使其能夠在口腔環(huán)境中穩(wěn)定發(fā)揮功能是研究的難點(diǎn)。目前以絲素蛋白、PDA 等仿生材料為載體來(lái)固定生物功能分子，發(fā)揮二者的協(xié)同作用是未來(lái)的研究趨勢(shì)。

4、仿生修飾的方法

直接利用簡(jiǎn)單的浸漬法，即將鈦材料浸漬在含有特定濃度生物功能成分的溶液中即可實(shí)現(xiàn)生物功能分子在表面的直接固定，但鈦表面一般需進(jìn)行預(yù)處理，如氧等離子體處理［24］、氨基功能化（硅烷化）或激光蝕刻［21］。對(duì)于膠原仿生修飾也可利用陽(yáng)極吸附法改善其與鈦表面的吸附［25］。也有研究先通過(guò)電化學(xué)過(guò)程，隨后采用浸漬法［20，26］。但是，有研究指出利用簡(jiǎn)單浸漬法與復(fù)雜的修飾技術(shù)（如陽(yáng)極吸附法、化學(xué)交聯(lián)法、共價(jià)鍵結(jié)合法）相比，其形成的鈦表面的細(xì)胞學(xué)效果類(lèi)似［25］。

另一方面，越來(lái)越多的研究支持首先在鈦材料表面構(gòu)建絲素蛋白、PDA等仿生涂層，再將上述生物功能分子固定在仿生涂層表面。此方法不僅更利于生物功能分子的穩(wěn)定性，也可顯著提升仿生涂層的生物相容性［4，14］。

5、涂層評(píng)價(jià)方法

5.1涂層穩(wěn)定性能和結(jié)合力檢測(cè)

涂層的穩(wěn)定性能檢測(cè)主要包括對(duì)比分析磷酸緩沖鹽溶液浸泡前后涂層體積的變化（常通過(guò)免疫熒光技術(shù)）、表面元素含量變化（常通過(guò)X射線(xiàn)光電子能譜技術(shù)）或測(cè)定洗脫液中功能成分的溶解量（常通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）等方法［14，23］。涂層結(jié)合力的檢測(cè)方法主要包括剪切粘接強(qiáng)度、拉伸粘接強(qiáng)度及脫粘接模式分析。通過(guò)比較粘接強(qiáng)度大小、分析脫粘接模式的比例，可以反映涂層結(jié)合力強(qiáng)弱［7］。

5.2軟組織黏附性能檢測(cè)

進(jìn)行軟組織黏附性能評(píng)價(jià)包括蛋白水平、細(xì)胞水平或組織水平的分析，可進(jìn)行體外2D細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、體外3D細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或體內(nèi)試驗(yàn)。種植體與周?chē)浗M織上皮細(xì)胞的主要黏附結(jié)構(gòu)為半橋粒，半橋粒與基質(zhì)連接由整合素與 LN-332 介導(dǎo)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡等實(shí)驗(yàn)分別在基因和蛋白水平對(duì)整合素、LN-332及其他黏附相關(guān)蛋白的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，間接反映上皮細(xì)胞在修飾表面的黏附能力的強(qiáng)弱［27］。牙齦成纖維細(xì)胞是牙齦結(jié)締組織的主要細(xì)胞，其功能主要包括參與細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和改建、分泌細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子、與其他細(xì)胞建立細(xì)胞間接觸。成纖維細(xì)胞的功能評(píng)估主要包括黏附、增殖、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)合成能力。成纖維細(xì)胞在待測(cè)基質(zhì)表面增殖活性、細(xì)胞鋪展能力、細(xì)胞外基質(zhì)合成等的增加，表明材料表面更利于富含膠原的結(jié)締組織及軟組織封閉的形成。組織學(xué)水平分析主要評(píng)估種植體周?chē)浗M織尺寸、結(jié)締組織比例、膠原纖維走向、軟組織封閉性和軟組織黏附強(qiáng)度等。其中，軟組織封閉性是較為直觀的評(píng)價(jià)指標(biāo)，可通過(guò)滲透實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。利用示蹤劑進(jìn)行模型滲透率的評(píng)估可以反映界面的封閉質(zhì)量。目前常用的示蹤劑主要包括辣根過(guò)氧化物［28］、氚化水或其他放射性水等［29］。軟組織黏附強(qiáng)度目前暫無(wú)直接的量化分析方法。有學(xué)者通過(guò)檢測(cè)從軟組織中拔除種植體所需的分離強(qiáng)度作為評(píng)價(jià)軟組織黏附強(qiáng)度的量化指標(biāo)，是一個(gè)有前景的實(shí)驗(yàn)方法［30］。

6、結(jié)語(yǔ)

鈦的仿生表面改性逐漸成為研究熱點(diǎn)。通過(guò)絲素蛋白、PDA、CS制備仿生涂層，或采用膠原、黏附相關(guān)蛋白、RGD多肽序列、生長(zhǎng)因子等進(jìn)行表面仿生修飾，均可在不同程度上改善鈦材料與軟組織的黏附性能，具有良好的應(yīng)用前景。但同時(shí)如何提高仿生表面的長(zhǎng)期穩(wěn)定性仍為本領(lǐng)域的挑戰(zhàn)，需要進(jìn)一步探索及研究。

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（2022-04-30收稿2022-10-15修回）

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